干旱在世界范圍內(nèi)造成了嚴(yán)重的作物損失，預(yù)計氣候變化將在未來增加其發(fā)生率。與許多作物的情況類似，參考植物擬南芥Arabidopsis thaliana (Ath)被認(rèn)為對干旱敏感，而正如我們所證明的，其近親擬南芥Arabidopsis lyrata (Aly)和 Eutrema salsugineum(Esa)具有抗旱性。為了了解這種可塑性的分子基礎(chǔ)，我們使用發(fā)育匹配的植物進行了深入的表型、生化和轉(zhuǎn)錄組比較。證明 Aly 通過早期生長減少、代謝適應(yīng)和信號網(wǎng)絡(luò)重新布線對減少的可用水量做出最敏感的反應(yīng)。相比之下，高基礎(chǔ)脯氨酸水平、ABA 信號轉(zhuǎn)錄和晚期生長反應(yīng)證明了 Esa 處于不斷準(zhǔn)備的模式。對壓力敏感的 Ath 的反應(yīng)晚于Aly，早于Esa，盡管它的反應(yīng)往往更為。所有物種都以相似的敏感性檢測缺水；響應(yīng)差異編碼在下游信號和響應(yīng)網(wǎng)絡(luò)中。此外，在 Aly 和 Esa 中以較高基礎(chǔ)水平表達的幾種信號基因已被證明在Ath中過度表達時可提高水分利用效率和抗旱性。我們的數(shù)據(jù)展示了密切相關(guān)的十字花科實現(xiàn)抗旱的對比策略。

圖1.擬南芥(Ath)、擬南芥(Aly)和Eutrema salsugineum (Esa) 的生長階段進展和抗旱性

作為了解十字花科干旱脅迫反應(yīng)的重要第一步，對干旱敏感的Ath及其據(jù)報道更具抗性的近親Aly和Esa進行了對照比較研究。比較干旱研究的關(guān)鍵是需水量對發(fā)育參數(shù)的依賴性。由于物種之間的發(fā)育時間不同，首先定義了土壤生長的 Ath、Aly 和 Esa 植物的發(fā)育進程。在 WW 條件下，Ath 遵循先前描述的時間線，而 Aly 和 Esa 的葉子出現(xiàn)較慢（圖1a）。這種差異從發(fā)芽到第三片葉子的出現(xiàn)（階段 1.03）最為明顯，隨后更加同步（圖 1a）。對于生理和發(fā)育的可比性，使用 1.06 階段的植物作為起點，Ath 在 14 DAS 時達到，Aly 在 22 DAS 時達到，Esa 在 22 DAS 時達到。對于每個物種，使用 WIWAMxy 表型平臺種植、澆水和成像 128 株植物。在發(fā)育階段 1.06 (T0)，WD 子集連續(xù) 15 天 (T0-T14) 停止?jié)菜Ｔ?T14 WD 植物出現(xiàn)萎蔫的視覺跡象并重新澆水以確定存活率作為抗旱性的量度。幾乎所有 Aly 和 Esa 個體都康復(fù)了，分別對應(yīng)于 96% 和 98% 的存活率；只有 76% 的 Ath 植物在嚴(yán)重干旱期間存活（圖 1b）。

圖2.充分澆水(WW)和缺水(WD) 條件下的玫瑰花結(jié)生長動態(tài)

根據(jù)預(yù)測玫瑰花結(jié)面積（PRA）確定了隨時間的增長。盡管這三個物種都對水資源利用率的降低做出了反應(yīng)，花環(huán)生長也減少了，但它們的動態(tài)卻有很大的不同。Aly在T3時首先對缺水作出反應(yīng)，而Ath和Esa僅在T5和T6時表現(xiàn)出顯著的生長減少（圖2a-c）。而在治療的第一天（T0），Aly PRA（211 mm2）明顯大于Esa（94 mm2）和Ath（100 mm2）。然而，較大的Aly花環(huán)在停止?jié)菜蟛]有導(dǎo)致較高的耗水量（圖2d），這可能是生長減少較快的原因。生長減少時測得的土壤含水量分別為1.76（Aly）、1.66（Ath）和1.50（Esa）（圖2d）。因此，盡管預(yù)期這三個物種都會因水分利用率的降低而出現(xiàn)生長減少的反應(yīng)，但與敏感的Ath相比，這兩個抗性物種明顯表現(xiàn)出相反的反應(yīng)動力學(xué)。這種不同的反應(yīng)可能表明，盡管Aly和Esa在進化上很接近，但它們在抗應(yīng)激方面進化出了不同的策略。

為了更好地了解生長減少的基礎(chǔ)，我們更詳細(xì)地分析了葉片大小。在WD條件下，除子葉和晚出葉外，所有物種（L1-L11）的葉面積均顯著減少（圖3a-c）。這種增長減少在 Aly 中最為顯著（60%），而在 Ath 和 Esa 中分別減少了 42% 和 44%。值得注意的是 Aly 葉子的快速強響應(yīng)，例如 Aly L1 的表面積減少了 42%，而 Esa 和 Ath 中 L1 的表面積分別減少了 13% 和 23%。成熟 L6 的細(xì)胞分析表明，細(xì)胞大小和細(xì)胞數(shù)量在 Ath 中減少到相似的程度。在 Aly 中，細(xì)胞數(shù)量（即增殖）的減少最為顯著，而在 Esa 中，細(xì)胞大?。瓷L）受到的影響最為顯著（圖 3d、e）。細(xì)胞面積和數(shù)量的減少導(dǎo)致所有物種的細(xì)胞密度更高（圖 3f），而氣孔指數(shù)僅因干旱而略微降低。所有三個物種的氣孔面積在干旱時同樣減少，而氣孔密度的增加在 Aly 植物中更為顯著。這些觀察結(jié)果進一步證明了 Aly 和 Esa 表現(xiàn)出不同的干旱響應(yīng)現(xiàn)象。

圖3.充分澆水(WW)和缺水(WD) 植物的葉和細(xì)胞參數(shù)

在有針對性的分析之后，我們的目標(biāo)是采用無偏見的系統(tǒng)方法來使用WGCNA 分析分子干旱響應(yīng)。將基因集與高度相關(guān)的特征基因（Pearson 相關(guān)系數(shù) > 0.9）合并后，定義了28個網(wǎng)絡(luò)模塊并進行了顏色標(biāo)記。八個模塊的表達模式與干旱處理顯著相關(guān)，因此可能代表脅迫反應(yīng)的不同特征（圖4a-c）。在這八個模塊中，只有一個與兩種抗性物種相關(guān)（圖 7b），但與 Aly 負(fù)相關(guān)，與Esa正相關(guān)。

圖4.表達互正交（EMOs）的聚類分析

干旱在世界范圍內(nèi)造成了嚴(yán)重的作物損失，預(yù)計氣候變化將在未來增加其發(fā)生率。與許多作物的情況類似，參考植物擬南芥Arabidopsis thaliana (Ath)被認(rèn)為對干旱敏感，而正如我們所證明的，其近親擬南芥Arabidopsis lyrata (Aly)和 Eutrema salsugineum(Esa)具有抗旱性。為了了解這種可塑性的分子基礎(chǔ)，我們使用發(fā)育匹配的植物進行了深入的表型、生化和轉(zhuǎn)錄組比較。證明 Aly 通過早期生長減少、代謝適應(yīng)和信號網(wǎng)絡(luò)重新布線對減少的可用水量做出最敏感的反應(yīng)。相比之下，高基礎(chǔ)脯氨酸水平、ABA 信號轉(zhuǎn)錄和晚期生長反應(yīng)證明了 Esa 處于不斷準(zhǔn)備的模式。對壓力敏感的 Ath 的反應(yīng)晚于Aly，早于Esa，盡管它的反應(yīng)往往更為。所有物種都以相似的敏感性檢測缺水；響應(yīng)差異編碼在下游信號和響應(yīng)網(wǎng)絡(luò)中。此外，在 Aly 和 Esa 中以較高基礎(chǔ)水平表達的幾種信號基因已被證明在Ath中過度表達時可提高水分利用效率和抗旱性。我們的數(shù)據(jù)展示了密切相關(guān)的十字花科實現(xiàn)抗旱的對比策略。

圖1.擬南芥(Ath)、擬南芥(Aly)和Eutrema salsugineum (Esa) 的生長階段進展和抗旱性

作為了解十字花科干旱脅迫反應(yīng)的重要第一步，對干旱敏感的Ath及其據(jù)報道更具抗性的近親Aly和Esa進行了對照比較研究。比較干旱研究的關(guān)鍵是需水量對發(fā)育參數(shù)的依賴性。由于物種之間的發(fā)育時間不同，首先定義了土壤生長的 Ath、Aly 和 Esa 植物的發(fā)育進程。在 WW 條件下，Ath 遵循先前描述的時間線，而 Aly 和 Esa 的葉子出現(xiàn)較慢（圖1a）。這種差異從發(fā)芽到第三片葉子的出現(xiàn)（階段 1.03）最為明顯，隨后更加同步（圖 1a）。對于生理和發(fā)育的可比性，使用 1.06 階段的植物作為起點，Ath 在 14 DAS 時達到，Aly 在 22 DAS 時達到，Esa 在 22 DAS 時達到。對于每個物種，使用 WIWAMxy 表型平臺種植、澆水和成像 128 株植物。在發(fā)育階段 1.06 (T0)，WD 子集連續(xù) 15 天 (T0-T14) 停止?jié)菜?。?T14 WD 植物出現(xiàn)萎蔫的視覺跡象并重新澆水以確定存活率作為抗旱性的量度。幾乎所有 Aly 和 Esa 個體都康復(fù)了，分別對應(yīng)于 96% 和 98% 的存活率；只有 76% 的 Ath 植物在嚴(yán)重干旱期間存活（圖 1b）。

圖2.充分澆水(WW)和缺水(WD) 條件下的玫瑰花結(jié)生長動態(tài)

根據(jù)預(yù)測玫瑰花結(jié)面積（PRA）確定了隨時間的增長。盡管這三個物種都對水資源利用率的降低做出了反應(yīng)，花環(huán)生長也減少了，但它們的動態(tài)卻有很大的不同。Aly在T3時首先對缺水作出反應(yīng)，而Ath和Esa僅在T5和T6時表現(xiàn)出顯著的生長減少（圖2a-c）。而在治療的第一天（T0），Aly PRA（211 mm2）明顯大于Esa（94 mm2）和Ath（100 mm2）。然而，較大的Aly花環(huán)在停止?jié)菜蟛]有導(dǎo)致較高的耗水量（圖2d），這可能是生長減少較快的原因。生長減少時測得的土壤含水量分別為1.76（Aly）、1.66（Ath）和1.50（Esa）（圖2d）。因此，盡管預(yù)期這三個物種都會因水分利用率的降低而出現(xiàn)生長減少的反應(yīng)，但與敏感的Ath相比，這兩個抗性物種明顯表現(xiàn)出相反的反應(yīng)動力學(xué)。這種不同的反應(yīng)可能表明，盡管Aly和Esa在進化上很接近，但它們在抗應(yīng)激方面進化出了不同的策略。

為了更好地了解生長減少的基礎(chǔ)，我們更詳細(xì)地分析了葉片大小。在WD條件下，除子葉和晚出葉外，所有物種（L1-L11）的葉面積均顯著減少（圖3a-c）。這種增長減少在 Aly 中最為顯著（60%），而在 Ath 和 Esa 中分別減少了 42% 和 44%。值得注意的是 Aly 葉子的快速強響應(yīng)，例如 Aly L1 的表面積減少了 42%，而 Esa 和 Ath 中 L1 的表面積分別減少了 13% 和 23%。成熟 L6 的細(xì)胞分析表明，細(xì)胞大小和細(xì)胞數(shù)量在 Ath 中減少到相似的程度。在 Aly 中，細(xì)胞數(shù)量（即增殖）的減少最為顯著，而在 Esa 中，細(xì)胞大?。瓷L）受到的影響最為顯著（圖 3d、e）。細(xì)胞面積和數(shù)量的減少導(dǎo)致所有物種的細(xì)胞密度更高（圖 3f），而氣孔指數(shù)僅因干旱而略微降低。所有三個物種的氣孔面積在干旱時同樣減少，而氣孔密度的增加在 Aly 植物中更為顯著。這些觀察結(jié)果進一步證明了 Aly 和 Esa 表現(xiàn)出不同的干旱響應(yīng)現(xiàn)象。

圖3.充分澆水(WW)和缺水(WD) 植物的葉和細(xì)胞參數(shù)

在有針對性的分析之后，我們的目標(biāo)是采用無偏見的系統(tǒng)方法來使用WGCNA 分析分子干旱響應(yīng)。將基因集與高度相關(guān)的特征基因（Pearson 相關(guān)系數(shù) > 0.9）合并后，定義了28個網(wǎng)絡(luò)模塊并進行了顏色標(biāo)記。八個模塊的表達模式與干旱處理顯著相關(guān)，因此可能代表脅迫反應(yīng)的不同特征（圖4a-c）。在這八個模塊中，只有一個與兩種抗性物種相關(guān)（圖 7b），但與 Aly 負(fù)相關(guān)，與Esa正相關(guān)。

圖4.表達互正交（EMOs）的聚類分析